题目：The landscape of immune dysregulation in Crohn’s disease revealed through single-cell transcriptomic profiling in the ileum and colon

期刊 | 时间：Immunity | January 30, 2023

DOI：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.01.002

概述：该文章对上百个样本进行了单细胞测序，得到了72w个单细胞表达数据。样本类型涉及不同临床状态、组织部位；经细胞注释涉及三大类细胞类型（上皮，基质，免疫）。作者对此进行了多角度的分析，例如细胞比例的差异与基因表达的差异性等。文章中提及的分析方法与工具对单细胞数据进阶分析提供参考。最后测序数据与样本信息以上传至Broad Single Cell Portal (SCP1884，https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell/study/SCP1884/human-cd-atlas-study-between-colon-and-terminal-ileum)

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相关缩略词

inflammatory bowel diseases ：IBDs 炎症性肠病

ulcerative colitis ：UC 溃疡性结肠炎

Crohn’s disease ：CD 克罗恩病

terminal ileum ：TI 回肠末端

colon ：CO 结肠

epithelial layer ：E 上皮层

lamina propria layer ：L 固有层

1、测序数据

（1）共对来自46例CD病人，25例non-IBD的136个组织样本进行单细胞测序；

（2）样本可按如下两类情况进行分组

  • 根据组织状态，可分为CD inflamed、CD non-inflamed、non-IBD healthy 共三组
  • 根据组织部位，可分为回肠末端TI与结肠CO 共两组

（3）大部分样本单独取自组织的上皮层(E)或者固有层(L)，少数样本取自混合层(N)

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2、细胞类型注释

根据cell-type markers，首先注释出3种主要的细胞类型：Immune，Epithelial，Stromal；然后进一步注释出共65种细胞亚类。

Table S2详细列出了注释上述细胞类型所使用的marker genes。

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3、细胞比例差异

首先对两个组织部位(TI/CO)的细胞组成比例在不同疾病状态下的变化展开分析

（1）经Principal coordinates analysis(R包vegan)，发现影响样本细胞组成的最大因素是取样方法，其次是组织状态/部位；

（2）使用Dirichlet regression(R包Dirichlet)，去除取样组织对细胞组成的影响，以分析特定部位下的不同状态样本细胞类型占比的差异。

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（3）结合存在显著差异的细胞类型展开生物学讨论。例如与上皮细胞相比，免疫细胞与基质细胞在两种部位中的不同状态下都发生较大的重构。

4、基因表达差异

4.1 IBD风险基因

  • 计算已知的IBD风险基因在不同组织部位的不同细胞类型的特异性表达，使用基尼系数(Gini coefficient)评价表达的特异性。
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  • 与健康状态相比，其它状态的不同细胞类型表达特定风险基因的比例差异。（如下图：一个点表示一种细胞类型对于某基因的表达比例，横、纵坐标分别表示不同状态）

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4.2 MAST差异分析

使用MAST模型校正混杂因素后，分析每种组织部位里，inflamed与healthy相比的不同细胞类型的差异基因。

  • （1）首先分别统计上调与下调的基因数目；
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  • （2）分析两种组织部位不同细胞类型差异表达的一致性；
  • （3）通过KEGG的GSEA分析(R包fgsea)，发现在不同组织部位的三大类细胞类型中显著上调或下调的通路。（如下图的横坐标理解为每大类细胞类型中细胞亚类比例）

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之后文章重点分析两类基因(MHC class II与细胞表面黏蛋白分子)的差异性表达(两个维度：不同状态，不同部位)展开生物学讨论。

5、 稀有细胞类型分析

肠内分泌细胞(Enteroendocrine cells, EECs)在肠道免疫发挥重要作用，但由于占比很低，一般难以分析；

  • 经marker基因鉴定(CHGA,CHGB)，在TI的上皮细胞群中发现了670个EECs，并进一步分为8个亚群；
  • 分析每个亚群里不同样本、不同状态的组成比例；
  • 对其中两个占比较高的亚群，分析不同状态下的差异基因及其生物学意义。

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6、肌成纤维细胞分析

在两个肌成纤维细胞亚型中(HHIP+NPNT+ and GREM1+GREM2+)，前者在TI的inflammed状态下扩增，并展开如下分析：

  • （1）HHIP+NPNT+亚型高表达胶原蛋白相关基因；GREM1+GREM2+亚型却低表达；
  • （2）通过拟时序分析发现驱动GREM1+GREM2+型向HHIP+NPNT+型转换的关键基因

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（3）挑选出具有转录调控作用的16个轨迹发育相关基因，在人类正常肠道成纤维细胞系中做siRNA干扰实验，以做进一步验证与筛选。

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