Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer’s Disease

Cell. 2020 Aug 20 | IF=41.5

DOI: 10.1016/j.cell.2020.06.038

image-20220610155820989

这是关于AD的第一次空间转录组学的相关研究。如下为该文章中涉及空间转录组分析部分的简要笔记，具体可参看原文。

1、实验设计

image-20220609140300185

小鼠模型

AD模型小鼠3月龄、18月龄各2只；6月龄、12月龄各1只；共8只。正常对照小鼠同。

每次取小鼠脑组织3张连续的切片，中间一张用于空间转录组测序、两旁的切片用于免疫组化检测。

对于3月龄、18月龄小鼠，分别取左右脑的冠状切片；对于6月龄、12月龄的小鼠仅取右脑的冠状切面。所以共有20组切片数据。

空间转录组测序

对于每张切片，测序单位为直径100um的TD(tissue domain，可以理解为spot)；平均每个TD测得6578个基因表达信息。

平均每张切片有500个TD，总共10327个TD，共覆盖了14个脑组织区域

image-20220609144958989

免疫组化实验

对于每张切片，共检测4种指标：

  • Aβ load (6E10 staining)

  • reactive astrocytes (GFAP)

  • presence of neurons (NeuN)

  • nuclei (DAPI)

由于3张连续切片，每张切片10um厚度，因此文章认为可将对应TD的基因表达与免疫组化指标关联起来。

其中对于关键的Aβ load指标，根据TD区域内的荧光信号标准差计算每个TD的Aβ index。

从文章给出数据来看，正常组小鼠的Aβ index均为0。而在AD模型小鼠中，从3月到18月，Aβ index不断增高。

其中在18月龄的AD模型鼠中平均每张切片有1565个 Aβ plaques，平面面积在 78.5–4,950 um2

image-20220609150301613

2、两次差异分析

使用EdgeR包拟合GLM分布，然后进行quasi-likelihood F-test差异分析

2.1 genotype model

  • 3月龄的AD模型鼠与正常对照鼠的TD差异基因
  • 18月龄的AD模型鼠与正常对照鼠的TD差异基因

2.2 Aβ model

研究不同TD的基因表达变化与Aβ index的关系

计算得到的LFC表示每增加一单位的Aβ index，TD中基因表达的变化Log倍数。

同样也是分为3月与18月龄小鼠单独分析。

2.3 通路关联分析

将上述两类差异基因综合考虑(genotype model与Aβ model)，可以反应基因不同层次的表达依赖关系。可进一步将差异基因关联到通路，将通路组成基因的两种平均LFC作为该通路的差异表达特征。

如下左图可以看出Antigen processing, chemotaxis, lysosomal degradation,以及 inflammation通路在18月龄鼠的结果中都具有正的LFC值。

而有意思的是Myelin通路在3月与18月的Aβ model 具有相反的变化，即随着Aβ index的增多，3月龄中该通路正相关；18月龄中该通路负相关。

image-20220610142919769

3、WGCNA分析

对全部的10327个TD做WGCNA分析

选取了Top50方差(高变)基因，分为了12个模块。每个模块的组成基因见附件Table S3。

WGCNA包分析的相关指标：(1)Soft power 14；(2)deepSplit = 4; (3)signed network

（1）根据模块的组成基因与cell signature基因集的超几何检验分析，判断每个模块的细胞类型特征。

如下图，是去除了没有任何显著富集或者组成基因数过多的模块。

image-20220609154631964

其中热图中有颜色的第一个格子的上面数字表示交集基因数；中间数字表示预期交集基因数；下面数字表示矫正后的P值

DAM : disease-associated microglia; A1：inflammatoryastrocytes

（2）取模块组成基因的两类平均LFC，作为该通路的差异表达特征。

如下图所示，Purple与Red的模块差异变化特征最明显。根据

之后主要关注了与Aβ最相关的red与purple模块。

image-20220610142953823

（3）对red与purple模块内基因的通路富集分析表明

  • red模块与myelin category相关，在AD的早期活跃、晚期不活跃。
  • purple模块与chemotaxis, lysosomal degradation, inflammation, antigen processing categories相关。

4、PIG Module

Purple module，57个基因组成，Plaque-induced genes(PIGs)

（1）PIGs模块的两类LFC在18月份都为最大值

  • 如下图A：在genotype model比较中，随着年龄的增长，AD中PIGs基因相较于对照组高表达的程度越明显。
  • 如下图B：在Aβ model中，相较于AD组3月龄鼠，18月龄数各个区域的PIGs基因表达水平都显著增高。

image-20220610144533644

（2）通过GO通路富集分析，发现PIGs基因与经典补体级联、以及与补体级联相关的endocytosis、lysosomal degradation、antigen processing and presentation、immune response、oxidation-reduction富集相关

（3）通过cellular signature的基因集富集分析，发现PIGs基因与DAM/RAM小胶质细胞、A1星形胶质细胞相关。

如下图中标红的为PIGs的hub基因。

activated microglia (disease-associated microglia [DAM] or activated response microglia [ARM]

inflammatory astrocytes (A1)

image-20220610145454928

（3）进一步对PIGs基因，根据正常对照小鼠中的TD做WGCNA分析，分为3个sub module

  • green cluster组成基因与astroglia-expressed genes相关

  • blue/orange cluster与microglia相关

根据每个TD的Aβ index大小将AD对照组中的TD分为从高到低分为Q1、Q2、Q3、Q4共4组。

总体来看从对照组到AD组，从Q4到Q1，不同sub module之间的共表达程度增强。具体增强的基因对涉及哪些含义文章有详细论述。

image-20220609161738686

5、OLIG module

Red module，165个基因组成，主要与oligodendrocytes相关(OLIGs)

（1）通路富集分析表明主要与myelin sheath髓鞘相关；cellular signature富集分析、hub基因表明均与少突胶质细胞相关

（2）基因差异分析表明

  • 相比正常小鼠，AD鼠中OLGs基因均显著高表达；
  • 在3月AD鼠中，随着Aβ index增大，OLGs基因表达增多；在18月AD鼠中，随着Aβ index增大，OLGs基因表达反而降低。

在18月中，Genotype正相关，而Abeta负相关

image-20220609163538644

（3）文章进一步发现其实OLGs基因表达在不同年龄段存在不同的脑区域特异性。

  • 在3月AD鼠的FB、TH、HY区域中的TD与Aβ index呈正相关，而ENTI等区域与之呈负相关
  • 在18月AD鼠中AUDs呈负相关，ENTI等区域则呈正相关

image-20220610152339043

（4）按照Aβ index不断增大的Q4-Q1区域划分，比较不同区域的OLGs基因表达水平。

  • 在3月时，观察搭配在Q4~Q2时(mild Aβ index)，随着Aβ的增大，OLGs基因高表达；但是在最高的Q1，则低表达。
  • 在18月份，OLGs基因普遍低表达，可能是由于Aβ index普遍增强相关。

image-20220610153155619

6、结论

  • plaque-induced genes (PIGs) 模块表征了多种细胞类型的共表达网络关系，尤其是在AD晚期阶段参与了 complement system, oxidative stress, lysosomes, and inflammation等过程。

  • oligodendrocytegenes(OLIGs)模块基因参与AD早期病变过程，其中主要涉及myelin髓鞘相关通路。

image-20220610154747798

7、数据获取

  • 将文章中所涉及到的所有图片整理、汇总到https://alzmap.org/网站中，可供交互式浏览。

  • 将空间转录组基因表达测序数据上传到GSE152506中

  • 文章中所有的图片、测序数据都可在https://www.synapse.org/#!Synapse:syn22153884/wiki/603937中获取。