AD星形胶质细胞与小胶质细胞的snRNA-seq数据分析

Diverse human astrocyte and microglial transcriptional responses to Alzheimer’s pathology

Acta Neuropathologica (2022) 143:75–91

IF=17

https://doi.org/10.1007/s00401-021-02372-6

文章分析思路

1、测序样本

  • 24个样本：AD与NDC的EC(entorhinal)与SSC(somatosensory) cortical region(2×2×6)
  • 使用Immunohistochemistry量化每个样本的p-Tau与Amyloid-beta指标

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  • 本文是想研究astrocyte星形胶质细胞与microglial小胶质细胞在AD中所发挥的作用。但是The proportions of microglia and astrocytes defined by snR- NASeq of nuclei isolated from the human brain post-mortem are low and variable。
  • 因此本文采取的方式是使用阴性选择方法去除样本中的neuron与oligodendroglia，间接富集Astro与Micro，再进行snRNA-seq测序。测序数据已经上传到GSE160936。

2、鉴定细胞类型

  • 经数据预处理后，使用AUCell，结合细胞marker基因进行细胞类型注释，如下图所示Astro(52706)与Micro(27592)占大部分

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  • 文章为了验证所富集的Astro与Micro不存在偏差bias，做了进一步的分析。即对上述24个样本又做了非富集的snRNAseq测序，注释出细胞类型。通过比较同一样本的富集与非富集的Astro(Micro)细胞类型的Top10% HVG高变基因的相关性，从而表示富集到Astro(Micro)不存在bias。

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24+24=48个snRNAseq，这篇文章应该花了很多钱。

3、差异基因分析

  • 文章并非按一般的AD/NAD差异分析，而是将基因表达与样本的p-Tau(或Amyloid-beta)指标进行回归分析，并校正性别、线粒体含量等因素。

  • 此时基因差异表达倍数的含义表示为pTau (or amyloid density)发生一单位的变化，基因表达差异的log2倍数（斜率）。如下例图所示

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文章提到是使用MAST包的zlm()进行的回归分析。

  • 按照上述思路可分别对Astro与Micro进行Amyloid-beta、pTau两个指标的回归分析，即得到4类差异基因。如下图所示在Astro中的两类差异基因火山图。从右侧的韦恩图可以得到有208个基因表达与Amyloid-beta、pTau正相关等信息。

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  • 继续以Astro差异基因为例。文章将Amyloid-beta、pTau两个指标的回归差异基因进行通路富集分析(GO/Reactome/Wikipathways)，得出结论：Increased expression of genes related to metal ion homeostasis, proteostasis, and inflammation in astrocytes with AD pathology。同法，也对Micro差异基因结果进行类似的分析。

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4、细胞通讯分析

  • 使用CellChat包对Astro与Micro进行ligand–receptor的细胞间通讯分析。
  • 根据配受体基因与Amyloid-beta、pTau两个指标的相关性，将CellChat结果分为3类：（1）Amyloid-beta and pTau；（2）Amyloid-beta only；（3）pTau only
  • 如下图是Amyloid-beta and pTau的结果，可结合配受体对的功能展开分析与讨论。

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5、共表达网络分析

  • 文章使用MEGENA进行共表达网络分析，计算得到astrocytes与microglia分别在EC与SSC的module；使用SCENIC进行转录因子分析，也分别得到astrocytes与microglia分别在EC与SSC的regulons。

  • 然后使用AUCell包计算出每个细胞核的对应细胞类型模块的score。然后结合Aβ/pTau指标进行类似上述差异基因的回归分析。即Aβ/pTau指标变化与模块表达score是否存在相关性。根据分析结果，初步得到结论：The EC and SSC show similar co‑expression signatures。如下图展示部分module与regulon

    MEGENA–module

SCENIC–regulon

  • 根据上述得到的基因模块表达特征与功能特征，分析AD GWAS基因所发挥的cell-specific功能。例如下图所示：GPNMB已知是AD的biomarker，它是Micro的amyloid-beta and pTau 正相关模块(module11)的hub gene；而且该基因在AD的Micro中也是相对高表达。

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6、亚群特征分析

  • 根据之前的细胞类型注释，将Astro与Micro进行在亚群分析。

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  • 在亚群分析时，主要结合细胞亚群的marker基因功能，是否为上述的差异基因；亚群熷细胞是否特异表达/参与上述计算得到的module/regulon等，具体可参看原文献。

我的想法：这篇单细胞文章测序样本量大，且有创新之处，即富集的Astro与Micro。而且计算差异基因方式很有新意，即进行病理指标的回归，也许更可以反映出基因表达水平与AD病理特征的关系。文章也使用多种多样的单细胞数据分析手段，例如亚群分析、细胞通讯分析、转录因子分析。总之无论是测序数据还是分析方法，都挺有借鉴价值的。